制備型液相色譜,按照色譜柱和樣品量的大小,可分為以下類型:
(1)低壓液相色譜;
(2)中壓液相色譜;
(3)高壓液相色譜;
(4)快速色譜。低壓、中壓與高壓液相色譜
1、快速色譜
柱壓通常為2bar(或30psi)左右,對(duì)于那些容易分離的簡單混合物,由于快速色譜具有操作簡便、經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點(diǎn),常常是實(shí)驗(yàn)室的選擇。但快速色譜不同于一般的層析分離,這種分離沒有壓力,而快速分離通常使用瓶裝氮?dú)饧訅?,使流?dòng)相具有一定的流速,從而縮短了分離時(shí)間。
快速色譜使用的柱子一般是玻璃柱,柱直徑為3~10cm.長度為7~15cm??焖偕V中使用*泛的固定相為硅膠。采用的粒徑通常為:25~40μm,40~63μm或63~200μm的球形固定相。其它如鍵合相、氧化鋁、聚酰胺吸附劑也常用作快速色譜的固定相使用。
2、低壓色譜(LPLC)
柱壓一般低于5bar(或75psi)。
低壓色譜一般是由蠕動(dòng)泵、進(jìn)樣閥和檢測器組成,可以連續(xù)化,實(shí)現(xiàn)自動(dòng)的梯度淋洗和餾分收集等操作。色譜柱管一般是玻璃或聚合物材料的,長度一般為240-440mm,內(nèi)徑為10-40mm。
對(duì)于大多數(shù)在紫外區(qū)有吸收的物質(zhì),光學(xué)檢測器很常用。填料一般使用軟質(zhì)的葡聚糖、瓊脂糖、纖維素、合成高聚物或離子交換劑,粒徑一般為40-60μm。
3、中壓液相色譜
柱壓在5-20bar(或75-300psi)之間,廣泛用于實(shí)驗(yàn)室和工業(yè)規(guī)模的生物制品(如動(dòng)物臟器提取液、濃縮液、體液、植物提取液、生物技術(shù)發(fā)酵液等。往往需要經(jīng)過濾膜作初級(jí)凈化的處理,以提取或純化所需的產(chǎn)品。
中壓液相制備色譜的主要部件為輸液泵、進(jìn)樣閥、檢測器、餾分收集器等,比如瑞士公司的早期的中壓液相制備色譜,其輸液泵最大流速可達(dá)156mL/min,并配有阻尼器,以保證液流的穩(wěn)定;進(jìn)樣器配有0.5-50mL的不同體積的定量管;檢測器有紫外和示差折光檢測器,流通池體積比較大,允許大流量流動(dòng)相通過而無需分流;餾分收集器有原盤式和排式兩種,圓盤式的接收管最多達(dá)80個(gè),而排式的則更多;色譜柱內(nèi)徑10-105mm,長度250-1760mm不等。
對(duì)于一般中壓制備色譜,當(dāng)色譜柱直徑較大時(shí),柱頭往往設(shè)計(jì)成錐形或有類似于傘狀的液流導(dǎo)向結(jié)構(gòu),使得當(dāng)大量樣品進(jìn)入到柱頭上時(shí),能迅速地分散到整個(gè)柱橫截面上,及時(shí)被流動(dòng)相沖走,避免了因樣品的局部過濃而引起柱超負(fù)荷和譜帶加寬。柱子填料則采用比較耐壓的交聯(lián)改性的多糖凝膠,聚合物微球,復(fù)合材料介質(zhì)或硬質(zhì)SiO2基質(zhì)的化學(xué)鍵合相等,粒徑一般在25~40μm(常用的填料尺寸是15-25μm,25-40μm或40-63μm),可采用濕法或干法裝柱。
4.高壓液相色譜(HPLC)
這是指柱壓一般大于20bar(或300psi)的“高壓(或高效)液相色譜”,通常指所用色譜柱的塔板數(shù)大于2000,一般是在2000~20000的范圍之間。
當(dāng)需要從大量的物質(zhì)中分離純化不足1%的所需成分時(shí),分離工作將會(huì)十分困難,往往在純化的最后階段需要使用10μm或更小顆粒的高效填料。為獲得所需微量組分,可采用如下分離手段:制備型分離→半制備型分離→分析型分離→產(chǎn)物。為提高每次分離獲得純品的數(shù)量,制備型高壓液相色譜分離通常在超載情況下運(yùn)行。
高壓液相色譜,即目前常用的高效液相色譜。色譜柱內(nèi)填裝的是粒度范圍較窄的微小顆粒固定相(3~30μm),為使流動(dòng)相流出,需采用較高的壓力,同時(shí)系統(tǒng)的復(fù)雜性及成本亦增大,但分辨率可得到較大的提高。而填裝較大顆粒的固定相時(shí),如中壓液相色譜系統(tǒng),裝柱較容易,柱的通透性較高(只需較低的泵壓力),可采用更大的色譜柱和更經(jīng)濟(jì)的儀器,由此分辨率也較低。
制備型液相色譜滿足從毫克級(jí)到克級(jí)樣品的純化,適用于制備液相色譜分離方法的開發(fā)和優(yōu)化,既可以在摸索方法時(shí)節(jié)省樣品和溶劑,又可以獲得一定數(shù)量的純品,高??蒲腥藛T和企業(yè)研發(fā)人員分離純化得力助手。